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詳述Pcr儀的四大分類及常見問題解答

PCR就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內(nèi)In Vitro的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來的一百億至一千億倍。根據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測的標(biāo)準(zhǔn)，可以將PCR儀分為普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀四類。

普通PCR儀

一般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。主要是用作簡單的，對目的基因退火溫度的擴(kuò)增。

主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。

梯度PCR儀

一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（通常12種溫度梯度）的稱之為梯度PCR儀。因?yàn)楸粩U(kuò)增的不同的DNA片段其較為適合的退火溫度不同，通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的較為適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也節(jié)約經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。正真的梯度，是每一排管都有的加熱控溫探頭，2009年為止只有美國ABI公司可以做到。其他的都是從兩頭的熱傳遞來設(shè)計(jì)控溫。

梯度PCR儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機(jī)構(gòu)。

原位PCR儀

（有些品牌的PCR儀具有普通PCR、梯度PCR、原位PCR的功能，通過替換模塊進(jìn)行多用途開展實(shí)驗(yàn)工作）

是用于從細(xì)胞內(nèi)靶DNA的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴(kuò)增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。可保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測到靶DNA，還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實(shí)用價(jià)值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀

在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。

熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道；有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測一種目的基因的擴(kuò)增量，需多次擴(kuò)增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，實(shí)現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。

PCR儀常見問題及回答

1. cDNA產(chǎn)量的很低
可能的原因：
*RNA模板質(zhì)量低
*對mRNA濃度估計(jì)過高
*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足
*同位素磷32過期
*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)*過50μl
2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺
*較為常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系
*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)
*建議在試驗(yàn)中加入對照RNA
**鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要*過1/10
*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于*鏈合成。由于RNA模板存在二級結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。
*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：
a. 將*鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。
b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行*鏈反應(yīng)。
3. 產(chǎn)生非特異性條帶
*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。
*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。